本应用阐述了使用 µ-Slide I Luer _0.8 通道载玻片（ibidi，货号80196）在静态条件下培养细菌生物膜，并通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）与扫描电子显微镜镜（SEM）联合成像的实验方案。

　　

　　将铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa  DSM 50071_T 接种到 µ-Slide I Luer _0.8 通道载玻片中，培养3天。为促进细胞贴壁及表面生物膜的形成，在培养约36小时后更换培养基，以去除游离细胞。为确认生物膜的形成，在生长培养基中添加了无毒光学示踪剂EbbaBiolight 680，该试剂适用于活细胞成像，它与细胞外基质中的蛋白质及多糖结合时会发出红色荧光，从而可作为细菌生物膜的可视化标记。

　　

　　基于用DAPI进行DNA染色并用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像的结果，细菌细胞附着并主要形成单层或双层结构。通过光学示踪剂发出的荧光信号增强，可以识别出更厚的生物膜结构。本实验旨在在同一张载玻片上结合多种成像技术。因此，在CLSM成像后，将细胞固定在同一张载玻片上，进行脱水处理，然后干燥，以便用于扫描电子显微镜（SEM）成像。实验室自制了一个3D模具，用于分离盖玻片，确保在操作过程中不破坏贴壁细胞的空间结构。随后，在分离出的盖玻片上，对形成的细菌细胞层进行2000倍至15000倍的放大成像。

　　

　　1、材料与试剂

　　•铜绿假单胞菌培养物 Pseudomonas aeruginosa culture（DSMZ，50071）

　　•胰蛋白酶胨（Thermo Fisher Scientific，211705）

　　•大豆蛋白胨（Millipore，1.07212）

　　•葡萄糖（VWR，24379）

　　•氯化钠（NaCl，VWR，27800）

　　•磷酸氢二钾(K2HPO4, Sigma, P3786)

　　•磷酸盐缓冲液（PBS，Sigma，P7994）

　　•EbbaBiolight 680（EbbaBiotech AB）

　　•4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, stock conc. 1 mg/mL, Thermo Fisher Scientific, 62248)

　　•25%戊二醛（Sigma，G7776）

　　•去离子水(diH²O)

　　•无水乙醇（Sigma，34852-M）

　　

　　1.2 缓冲液与溶液

　　培养基

　　•Tryptic soy broth (TSB; 17 g/L tryptone, 3 g/L peptone from soymeal, 2.5 g/L glucose,5 g/L NaCl and 2.5 g/L K²HPO⁴)

　　•TSB supplemented with 1:1000 EbbaBiolight 680

　　洗涤缓冲液

　　•1xPBS

　　染液

　　•1:1000 DAPI in 1x PBS (最终浓度为1 µg/mL)

　　30%、50%、70%、90%、100% (v/v)无水乙醇稀释液

　　•混合适当体积的去离子水和无水乙醇制得。

　　

　　1.3 仪器与设备

　　•µ-Slide I Luer _0.8 通道载玻片，ibiTreat组织处理（ibidi，80196）

　　•层流柜

　　•通风橱

　　•30°C恒温培养箱

　　•55°C恒温培养箱

　　•移液器

　　•冰箱

　　•干燥器

　　•手术刀或刀片

　　•剪刀

　　•镊子

　　•切割模具（如图1所示）

　　•倒置共聚焦显微镜（此处指：ZEISS LSM 880）

　　•ZEN black 2.3 SP1

　　•(Fiji Is Just) ImageJ 1.54f

　　•扫描电子显微镜（JEOL JSM-6480LV）

　　•金镀膜（此处指：JEOL JFC-1200 精细镀膜机）

　　•碳胶带

　　•JEOL JSM-6480 version 7.07

　　

　　图1：切割模具示意图—白色线条表示切割位置，沿着 µ-Slide I Luer _0.8 载玻片(底部)与储液池外边侧(顶部)

 

 

　　　2、实验步骤

　　　2.1 细菌生物膜附着

　　操作µ-Slide I Luer _0.8 前请阅读说明书，并遵循µ-Slide通用移液及液体更换建议。所有步骤需在无菌条件下进行。

　　实验开始前，将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa DSM 50071）接种于LB培养基（如100 mL锥形瓶），30°C、160转/分钟避光振荡培养过夜。按供应商说明，将培养物以1:100比例稀释于含1:1000光学示踪剂（optotracer）的培养基中（注：细胞浓度未调整至供应商推荐的值）。

　　关键提示：需将所需材料（如µ-Slide）置于30°C培养箱中平衡过夜。平衡处理可确保材料温度与环境一致，从而避免后续操作中因温差导致气泡形成。

　　1.根据说明书，将200 µL稀释菌液注入µ-Slide I Luer _0.8 通道载玻片，并用随附的盖子密封载玻片。

　　2.室温（RT）避光静置2小时，使细胞沉降并附着。

　　3.向每个储液池加入60 µL含光学示踪剂的TSB培养基，并用盖子封闭两侧储液池。

　　4.将µ-Slide于30°C避光静置培养1-2天。

　　5.按说明书从一侧储液池吸取100 µL液体，并加入100 µL新鲜配制的含光学示踪剂TSB培养基，完成培养基更换。

　　6.重复上一步骤5-10次，确保培养基完全替换，避免气泡产生。

　　7.向µ-Slide储液池注入60 µL无细胞补充TSB培养基。

　　8.再次将µ-Slide置于30°C避光静态条件下孵育1至2天，促进进一步贴壁及生物膜形成。

 

　　2.2 DAPI染色及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察

　　染色直接在µ-Slide I Luer _0.8 中进行，所有步骤需在通风橱内完成。

　　关键提示：避免一次性移除通道内全部液体，防止细胞干燥。

　　1.置换为1×PBS缓冲液：从一侧储液池移除100 µL培养基，向另一侧加入100 µL 1×PBS冲洗液。

　　2.重复步骤1（5-10次），直至培养基完全被1×PBS替代。

　　3.DAPI染色：按上述移液技术，将1×PBS替换为DAPI染色液，确保通道完全充满。

　　4.室温避光静置孵育 µ-Slide10分钟。

　　5.按照之前的移液技术，使用去离子水（diH²O）冲洗两次，去除多余染料。

　　6.按照之前的移液技术，最后用1×PBS冲洗一次。

　　7.成像：使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）拍摄附着细胞（图2）。

　　8.将µ-Slide于4°C冷藏保存（未固定样品最长2天），以待后续处理。

　　

　　图2：共聚焦显微镜下染色的铜绿微囊藻生物膜（红色：EbbaBiolight680（Cy3.5），蓝色：DAPI）。63x物镜。细胞大多呈单层附着。一些类似于生物膜的三维结构清晰可见，尤其是在红色信号较强的部分，突出显示了光学示踪剂与生物膜成分的结合。

 

　　2.3 SEM 样品制备

　　样品制备直接在µ-Slide I Luer _0.8 中进行，所有步骤需在通风橱内完成。

　　关键提示：请勿一次性移除通道内的全部液体，避免细胞干燥。所有清洗与溶液更换步骤均按说明书要求执行：从一侧储液池移除100微升溶液1，并向对侧储液池加入100微升溶液2。重复此操作直至溶液完全替换。

　　1.固定：按2.2节步骤1的移液技术，将通道及储液池内1×PBS替换为含2.5%戊二醛的1×PBS溶液，以固定贴壁细胞

　　2.室温孵育载玻片3-4小时（或4°C过夜）。

　　3.用1×PBS冲洗至少5次，彻底去除戊二醛。

　　4.梯度脱水：依次用30%、50%、70%、90%无水乙醇孵育15分钟/次，使附着的生物膜脱水。

　　5.完全脱水：100%乙醇处理两次，每次20分钟。

　　6.干燥：将通道载玻片置于55°C培养箱中干燥，不要盖上盖子，直至液体完全蒸发（本实验干燥2小时）。

　　7.将µ-Slide保存于干燥器中以待后续处理。

　　8.样品切割：按示意图（图3）用手术刀或刀片切割载玻片。

　　9.切割后的载玻片竖直存放于干燥器内（可保存数周）。

　　10.镀金：将载玻片切割为≈1 cm小段，镀金两次（图4）后用于电镜观察。

　　

　　图3：µ-Slide I Luer _0.8 载玻片切割示意图。红色虚线为切割线，彩色区域为可移除的盖玻片部分。

　　

　　图4：附着于µ-Slide I Luer _0.8 载玻片的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）细胞及生物膜的扫描电镜成像。（A）2000倍与（B）7500倍放大图像。