由于肿瘤是复杂的3D结构，3D肿瘤球体模型成为模拟肿瘤血管生成或转移等生理学相关肿瘤微环境的相关模型系统。本实验方案详细阐述了使用 µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流载玻片(货号：80376)将肿瘤球状体包埋在I型胶原凝胶与内皮细胞（人脐静脉细胞，HUVECs）中进行共培养。该模型还可以通过灌流培养技术来模拟体内生理条件。

　　

　　ibidi为球状体和类器官灌注培养提供多种解决方案：

　　

　　• µ-Slide III 3D Perfusion 

　　

　　• µ-Slide Spheroid Perfusion 

　　

　　• µ-Slide I Luer 3D 

　　

　　• µ-Slide With Multi-Cell µ-Pattern ibiTreat 

　　

　　• ibidi Collagen Type I 

　　

　　• ibidi Pump Systems and Accessories

　　

　　

　　相关文件:

　　

　　• Application Note 13: Endothelial Cells Under Perfusion 

　　

　　• Application Note 16 Immunofluorescence Staining Using the µ-Slide 8 Well high 

　　

　　• Application Guide 34: Cell Culture Under Flow 

　　

　　关键词：3D培养模型、肿瘤微环境、3D共培养；内皮细胞、肿瘤球状体、肿瘤血管生成

　　

　　1、实验材料

　　

　　注意：本方案针对Hep-G2肿瘤细胞球状体和HUVEC细胞进行了优化；使用其他细胞球状体或内皮细胞时，请调整试剂和缓冲液。

　　

　　1.1 试剂和缓冲液

　　

　　·人脐静脉内皮细胞（HUVEC，12203，Promocell 公司）

　　

　　·肿瘤细胞球状体（如 Hep-G2 Leibniz-Institut DSMZ, ACC 180）

　　

　　·内皮细胞生长培养基（Promocell，C-22010）

　　

　　·内皮细胞生长培养基 2（Promocell，C-22011）

　　

　　·PBS (14190144, Gibco)

　　

　　·Accutase细胞解离液（A1110501，Gibco）

　　

　　·I型胶原蛋白 、大鼠尾部（ibidi，50201）或牛（ibidi，50301），非胃蛋白酶化，5 mg/ml在17.5 mM或0.1M 酸中稀释至4 mg/ml

　　

　　·17.5 mM和0.1 M乙酸

　　

　　·10x DMEM（Sigma，D2429）

　　

　　·1x DMEM（Sigma，D5796）

　　

　　·培养基补充剂（如L-谷氨酰胺，视细胞类型而定）

　　

　　·1M超纯水中的NaOH

　　

　　·7.5%碳酸氢钠（Sigma，S8761）

　　

　　·无菌超纯水

　　

　　

　　1.2 设备与耗材

　　

　　·µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流载玻片(80376)

　　

　　·ibidi pump system泵系统/流体剪切力系统(10902)含一套灰色灌注管套装(10968)

　　

　　·标准细胞培养设备（超净工作台、细胞解离试剂盒、培养瓶、移液器、吸头等）

　　

　　·倒置显微镜

　　

　　·冰块和冷却架

　　

　　重要提示：为避免产生气泡，灌注装置和培养基的脱气至关重要。在实验开始前一天将以下部件放入培养箱中。只要不打开包装，就能保持无菌状态。   

 

　　• 灌注装置（在包装内）   

　　

　　 • 用于细胞接种的细胞培养基（在小容器中加入所需体积的培养基，并稍微松开盖子）由于气体在水和塑料中的溶解度与温度有关，因此有必要采用这一程序。在较高温度下，水和塑料吸收的气体比在较低温度下少。

　　

　　2、制备含球状体的3D凝胶

　　

　　在无菌条件下执行以下所有步骤。

　　

　　重要提示：此共培养实验的下一步需要先前生成的球状体。用于生成球状体的一些ibidi解决方案有µ-Slide Spheroid Perfusion(ibidi, 80350)。如需了解生成细胞球状体的详细步骤，请参阅ibidi Labware Application Note 63：Generation and Dynamic Culture of L929 Spheroids in the µ-Slide Spheroid Perfusion，或Bioinert ULA超低吸附表面系列产品(ibidi 81150, 80800 and 80420)

　　

　　1.用5µg/cm I型胶原蛋白（牛尾或大鼠尾，取决于所需的凝胶）预涂培养孔。涂上18µl 0.07µg/µl I型胶原蛋白溶液，在室温下孵育1小时。培养时间结束后，用PBS轻轻清洗。

　　

　　注意：此步骤对于防止3D凝胶脱落至关重要。因此，重要的是用H2O或PBS将I型胶原稀释至0.07µg/µl的最终浓度。

　　

　　2.取出先前生成的球状体（例如，根据说明书使用µ-Slide Spheroid Perfusion球体灌注通道载玻片）并在室温下将其收集到层流罩下的试管中。

　　

　　3.如果凝胶基质中需要补充剂，可将其添加到1x细胞培养基中，并将其置于层流罩中的冰块上。

　　

　　4.将所有其他成分和一个容量足以容纳凝胶总量的无菌试管放在层流罩的冰上。拆开载玻片的包装，将其也放入层流罩中。

　　

　　5.用移液管将除胶原蛋白和细胞悬浮液外的所有成分按表1和表2所列顺序移入试管中，并将其置于冰上。通过上下移液混合，然后放回冰上。

　　

　　移取胶原凝胶的重要注意事项

　　

　　移取凝胶时一定要使用预冷移液器吸头（4°C）。

　　

　　制备胶原蛋白I凝胶基质时，由于粘度较高，建议所有步骤都采用反向移液。将移液器按压至第二个压力点，将凝胶注入整个移液器吸头。仅在达到第一个压力点之前分配凝胶。这样移液器吸头中会有残留的凝胶需要丢弃，但体积会更加精确。另外，您也可以使用专为高粘度溶液设计的移液器。我们推荐使用EppendorfVisco吸头或Gilson Microman E吸头。

　　

　　注意：即使在4°C温度下，凝胶混合物也最多可使用5分钟，然后会出现部分凝胶化。

　　

　　6.确保I型胶原蛋白,鼠尾胶原蛋白在17.5 mM乙酸中稀释至4.0 mg/ml，牛尾胶原蛋白在0.1 M乙酸中稀释至4.0 mg/ml。请查看分析证书 (CoA)，以了解特定批次的胶原蛋白浓度。

　　

　　注意：在稀释胶原蛋白之前，必须用移液管上下移动几次，使其充分混合，以形成均匀的溶液。

　　

　　7.将胶原蛋白加入步骤5中制备的混合物中。用移液管充分混合，同时始终将试管置于冰上。

　　

　　8.将制备好的球体悬液加入混合物中。尽量在50µl的体积内收集尽可能多的球形体。然后，短暂涡旋混合样品。

　　

　　9.现在可以将混合物移入µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流载玻片。移液过程中，请将载玻片片放在冰上。

　　

　　提示：为避免因冰而划伤，请将µ-Side放入培养皿中，然后将带有玻片的培养皿放在冰上。

　　

　　10.取下载玻片上侧的保护膜，在每个孔中注入30 µl液体凝胶。避免产生气泡。

　　

　　

　　使用µ-Slide III 3D Perfusion三通道3D灌流载玻片灌注的实验流程示意图

　　

　　11.然后，将盖玻片放在载玻片的粘性部分。按压盖玻片以确保粘合区域密封严实。

　　

　　12.用随附的盖子盖住Luer鲁尔接头以保持无菌，然后将装有凝胶的载玻片放入细胞培养箱（37°C，5% CO² ）中培养45分钟，使其凝胶化。

　　

　　13.凝胶化后，用10倍物镜进行相差显微镜观察，可以看到胶原纤维。

　　

　　

　　表 1：使用I型胶原蛋白、鼠尾和 DMEM 制作凝胶的移液方案。所有成分均按移液顺序排列。

　　

　　

　　表 2：使用牛胶原I和DMEM制备凝胶的移液方案。所有成分均按移液顺序排列。

　　

　　3、内皮细胞的细胞接种

　　

　　在无菌条件下执行以下所有步骤。

　　

　　1.在开始使用ibidi pump system泵系统/流体剪切力系统开始灌注前,请在37°C的培养箱中预热Perfusion Set灌流装置和内皮生长培养基（ECGM  和 ECGM 2）。

　　

　　2.用Accutase处理HUVEC 1-2分钟，使其脱离。

　　

　　3.收集细胞悬浮液，然后离心并用少量培养基（ECGM）稀释，以便计数。

　　

　　4.计数细胞，并将其调整到培养基中2×106 cells/ml的最终浓度。

　　

　　5.在每个通道中加入约70 µl细胞悬液。从鲁尔接头中取出剩余的细胞悬液，重复接种步骤以提高细胞均匀度。

　　

　　6.用标准移液器吸头从鲁尔适配器中移除剩余的细胞悬液，并用提供的盖子盖住载玻片以保持无菌。

　　

　　7.将载玻片连同无菌湿巾放入培养皿中，然后其放入（37°C, 5% CO²）细胞培养箱中。8.在静态培养的情况下，培养基必须每2-3天更换一次。

　　

　　4、连接ibidi pump system泵系统/流体剪切力系统进行灌注

　　

　　重要提示: 内皮生长培养基2含有诱导细胞迁移和发芽的生长因子，如血管内皮生长因子和表皮生长因子。

　　

　　1.在细胞培养期间，按ibidi Pump System中的说明准备ibidi Pump System。将ECGM2培养基注入储液池。

　　

　　2.孵育2小时后，将载玻片连接到灌注系统，并注入ECGM2培养基。

　　

　　3.如需进行延时系列成像，将载玻片放入显微镜载物载物台的孵育箱（如ibidi Stage Top Incubator加热孵育系统/台式培养箱)并开始延时成像。如需单帧成像，请提前设置好显微镜参数，以尽可能缩短成像时间。不成像时，将载玻片放回培养箱。若要进行终点分析，请在实验结束时固定细胞，然后继续染色（见本文「染色」章节)或执行下游方案。

　　

　　

　　灌注培养条件下的延时成像实验装置示意图

　　

　　5、活细胞相差成像示例

　　

　　

　　灌注条件下共培养5天的相差图像，显示聚焦的球状体（左）和聚焦的HUVEC细胞（右）（I 型胶原鼠尾凝胶）

　　

　　

　　灌注条件下共培养5天的相差图像，显示聚焦的球状体（左）和聚焦的HUVEC细胞（右）（I 型牛胶原凝胶）

　　

　　6、染色

　　

　　6.1 材料

　　

　　•PBS (14190144, Gibco)

　　

　　•10%福尔马林，即用型（HT5011，Sigma Aldrich）

　　

　　•Alexa Fluor 488标记的抗CD31抗体，MA5-18135 Invitrogen）

　　

　　•Phalloidin-iFluor 647试剂（ab176758，Abcam ）

　　

　　•4′,6-diamidino-2-phenyl-indole （DAPI）（D9542 Sigma Aldrich）

　　

　　•Triton-X-100（A16046，Thermo Fisher Scientific）

　　

　　•破膜缓冲液（0.5% Triton X-100 加入 PBS）

　　

　　•封闭缓冲液（1% BSA + 0.2% Triton X-100 in PBS）

　　

　　•抗体稀释缓冲液（PBS 中含 1% BSA + 0.05% Triton X-100）

　　

　　•牛血清白蛋白（BSA）（A1470-10G，Sigma Aldrich）

　　

　　6.2 染色步骤

　　

　　1.为实验制备充足的破膜缓冲液和封闭缓冲液。

　　

　　2.断开载玻片与泵之间的连接。

　　

　　3.从Luer鲁尔接头处吸出细胞培养液。

　　

　　4.在一个Luer鲁尔接扣注入100 µl PBS，轻轻清洗细胞两次，直到看到液体从另一个鲁尔接口流出。

　　

　　5.用福尔马林（10%）代替PBS固定细胞。首先，从 Luer 端口移除PBS，然后在一个Luer端口加入100 µl福尔马林，再从另一个Luer端口移除。然后，再次加入100 µl福尔马林并孵育15分钟。

　　

　　6.去除福尔马林，用100 µl PBS冲洗细胞四次。

　　

　　7.在100 µl破膜缓冲液中孵育细胞10分钟（用破膜缓冲液交换PBS，类似于步骤 5--福尔马林交换）。

　　

　　8.去除破膜缓冲液，用100 µl PBS冲洗细胞两次。

　　

　　9.用100 µl封闭缓冲液（像使用福尔马林一样将PBS与封闭缓冲液交换）封闭30分钟。

　　

　　10.在封闭缓冲液步骤中，准备足够的抗体稀释缓冲液来稀释一抗和二抗。

　　

　　11.用抗体稀释缓冲液稀释标记抗体（或一抗）（1:100 稀释度）。

　　

　　12.用100 µl一抗溶液置换封闭缓冲液，然后在4°C孵育细胞过夜。

　　

　　13.从这时起，样品应尽可能保存在黑暗中。

　　

　　14.用100 µl封闭缓冲液清洗三次。

　　

　　15.用相同的抗体稀释缓冲液稀释（第二抗体和）类荧光素及DAPI（类荧光素 647 结合物 1:1000 稀释，DAPI 10 µg/ml）。

　　

　　16.用100 µl的二次染色液更换封闭缓冲液，并在黑暗中孵育过夜。

　　

　　17.用100 µl封闭缓冲液清洗三次。

　　

　　18.用PBS更换封闭缓冲液（每个通道100 µl）

　　

　　19.成像前保存在4°C黑暗处。最好立即进行成像，因为存放时间过长会降低成像质量。

　　

　　7、染色共培养的图像示例

　　

　　

　　在灌注条件下共培养3天后，对球状体和HUVEC细胞进行染色；细胞核：DAPI（蓝色），肌动蛋白丝：Phalloidin-iFluor 647（红色）；CD31（对HUVEC特异性）：Alexa Fluor 488标记的抗CD31抗体（绿色），（I 型胶原大鼠尾部凝胶）。

　　

　　

　　在灌注条件下共培养3天后，对球状体和HUVEC细胞进行染色；细胞核：DAPI（蓝色），肌动蛋白丝：Phalloidin-iFluor 647（红色）；CD31（对HUVEC特异性）：Alexa Fluor 488标记的抗CD31抗体（绿色），（I型胶原牛凝胶）。