细胞趋化实验原理

　　定义：趋化性（Chemotaxis，亦被称为化学趋向性）是趋向性的一种，指身体细胞、细菌及其他单细胞、多细胞生物依据环境中某些化学物质而趋向的运动。这对细菌寻找食物 (如葡萄糖) 十分重要，细菌以此趋进有较高食物分子浓度的地方，或远离有毒 (如苯酚) 的地方。在多细胞生物中，趋化性对其发展和其他正常功能一样不可或缺。正趋化性指趋向较高化学物质浓度的运动，而负趋化性则相反。

　　下面，我们介绍一个使用ibidiμ-Slide Chemotaxis3D分析嵌入3D牛胶原蛋白基质中的小鼠树突状细胞的趋化性的详细实验方案。

　　使用ibidiμ-Slide Chemotaxis细胞趋化载玻片的化学趋化实验，可以实时观察记录细胞的趋化行为。

　　一、实验材料准备

　　1）仪器：

　　细胞培养箱（高湿度，37℃，5%CO2）

　　带定时拍照功能的倒置相差显微镜

　　镜载加热孵育系统（37℃，5%CO2）

　　可选配置：全自动载物台，自动对焦系统（x，y，z），可平行观察3个腔室和多达4个玻片。

　　分析软件：ImageJ插件“手动跟踪”和“ibidi的趋化和迁移工具

　　注意：低倍率物镜（4x-10x）提供了更大的聚焦深度，因此是有利的。

　　2）树突细胞的培养：

　　树突状细胞(第8-10天)应用200 ng/ml LPS(在细胞培养基中，如表1所示)过夜激活。

　　表一：树突细胞培养所需的试剂和培养基

　　3）基质胶制备，Collagen I，bovine，1.6mg/ml

　　树突状细胞的化学趋化实验所需的耗材和试剂（如下表二）：

　　表二：化学趋化需要的耗材和试剂

　　表三：1.5 mg/ml牛胶原蛋白I凝胶的组成

　　操作步骤：

　　① 使用表一中的培养基制备9 x 106 cells/ml的细胞悬液

　　② 在1.5ml离心管中小心混匀表三中的成分1，2，3和4，避免产生气泡

　　③ 在另一1.5ml离心管中准备150μl的胶原蛋白（成分5）

　　④ 使用200μl枪头将步骤2中的100µl混合物转移到胶原蛋白管中（图一A）

　　⑤小心混匀（图一B），务必避免产生气泡

　　⑥ 向混合液中加入50μl细胞悬液（图一C）

　　⑦ 小心混匀（图一D），务必避免产生气泡

　　⑧ 随后，立即将混合物填充到通道中

　　⑨ 将载玻片放入培养箱45分钟使其凝固。之后，胶原纤维就会显现出来。

　　二、细胞趋化实验

　　1）趋化试剂：

　　化学趋化物：CCL19 (1.25 µg/ml in RPMI 1640 supplemented with 10%FCS)

　　无化学趋化物培养基：RPMI 1640 supplemented with 10% FCS

　　操作步骤：

　　① 凝胶凝胶化后，用不含化学趋化物或含化学趋化物的培养基加入细胞趋化载玻片的储液池中。

　　② 用65µl含有化学趋化物的培养基填充一个储液池，用65μl无化学趋化物培养基填充另一个储物池作为细胞趋化实验（+/-）。

　　③ 作为对照实验（-/-），用65µl无化学趋化物培养基填充两个储液池。

　　④ 按说明，将通道加液孔用塞子塞紧后可以进行图像采集。

　　⑤ 将载玻片置入镜载加热孵育系统中。

　　⑥ 调整好采集位点，进行4小时的观测，每2分钟采集一张图片。

　　图1.显微镜观察：由于3D环境，并非所有细胞都能完全聚焦，这取决于所使用的物镜

　　三、实验结果

　　如果满足以下参数并具有统计学相关性，则可以假设细胞定向迁移:

　　1）趋化实验的FMIII值大于fmii值，且p值<0.05;

　　2）各对照实验的FMIII和fmil应在零左右，p值应为p>0.05。

　　表四：HT1080细胞迁移参数比较。趋化性实验和对照实验的数据如下表所示。CCL19作为化学趋化物

　　当使用CCL19作为化学引诱剂时，可观察到趋化反应。趋化实验的FMIII和p值(瑞利检验的p值)都表明有定向细胞迁移。相反，在没有CCL19(对照实验)的情况下，可以观察到随机迁移。

　　图2. 在1.5mg/ml胶原凝胶中培养的树突状细胞的代表性细胞轨迹图。给出了趋化性实验（a）和对照实验（b）的结果