免疫荧光实验

　　

　　ibidi提供了一种简单且经济高效的方案，使用ibidi3孔可移除腔室载玻片（80381）对细胞进行培养、固定和染色。培养MCF-7细胞并用福尔马林溶液固定。细胞核用DAPI染色，肌动蛋白骨架用DYE-490鬼笔肽染色。可通过使用圆形的15mm盖玻片来减少所需的染色溶液的量。利用一级和二级抗体染色，通过免疫细胞化学可以探测其他细胞内结构。

　　

　　实验使用的材料：

　　

　　所使用的材料和试剂如下所示。此外，还需要配备一台有适当滤光片组的倒置或正置荧光显微镜。

　　

　　

　　·3孔可移除腔室载玻片（ibidi，80381）

　　

　　·3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片及配套工具，（ibidi，10815）

　　

　　·细胞：MCF-7（CLS，300273）

　　

　　·细胞培养基

　　

　　·细胞培养试剂

　　

　　·PBS

　　

　　·福尔马林中性缓冲液，10％（Sigma，HT5011）

　　

　　·染色试剂

　　

　　o  DAPI（Sigma，D954）

　　

　　o  DYE-490鬼笔环肽（Dynomics，490-33）

　　

　　·封片剂：FluoroshieldTM（Sigma，F6182）

　　

　　实验方案

　　

　　细胞培养，固定，染色和成像观察--都是在一个开放型小室中搞定：）

　　

　　

　　第1步：

　　

　　必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型，用2-6x10⁴细胞/ml在2-3天内产生汇合的单层。

　　

　　1. 在无菌条件下，打开3孔可移除腔室载玻片（ibidi，80381）包装。

　　

　　2. 像往常一样对细胞进行胰蛋白酶化和计数。MCF-7细胞浓度为3×10⁴细胞/ml 。

　　

　　3. 将1100μl细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃，因为这会导致细胞分布不均匀。为获得更均匀的细胞分布，请使用3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片。

　　

　　4. 用配套的盖子盖住。在37°C和5％CO₂下培养。

　　

　　5. 细胞至少培养24小时，或直到建立融合的单层。

　　

　　

　　第2步：

　　

　　固定是染色程序的第一步。目的是将细胞、细胞结构或组织维持在当前状态，并通过化学试剂在较长时间内保存制剂。

　　

　　1.小心地抽吸细胞培养基。

　　

　　2.用PBS洗两次。

　　

　　3.加入1100μl福尔马林溶液。

　　

　　4.室温下孵育30分钟。

　　

　　5.小心地抽吸福尔马林溶液。

　　

　　6.用PBS洗涤三次

　　

　　

　　第3步：

　　

　　应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用DAPI和DYE-490鬼笔环肽染色MCF-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。

　　

　　1.准备你的染色溶液：

　　

　　· PBS

　　

　　· DYE-490鬼笔环肽（每单元/玻片，50 μl/单元）

　　

　　· DAPI 1μg/ml

　　

　　2.小心吸出PBS。

　　

　　3.用盖玻片拾取工具抓取15毫米的圆形盖玻片，并将其放置在腔室孔内的圆形边缘上。

　　

　　4.将移液管尖端插入其中一个角槽中，将150μl染色液移入孔中。

　　

　　5.在室温下避光孵育30分钟

　　

　　

　　第4步：

　　

　　染色后清洗样本可最大限度地减少背景信号

　　

　　1.通过在一个角槽中添加950μl缓冲液来移除盖玻片。

　　

　　2.用Coverslip Pick-Up Tool盖玻片拾取工具或镊子抓取漂浮的盖玻片，将其从孔中取出。

　　

　　3.如有必要，重复洗涤步骤，抽吸缓冲液并在每孔中移液1100μl缓冲液。圆形的15毫米盖玻片无需额外的洗涤步骤。

　　

　　

　　第5步：

　　

　　从一个边缘开始，用手或用镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢，稳定的进行，以避免损坏细胞层。

　　

　　

　　第6步：

　　

　　完成染色程序后，必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还可防止样品脱水。

　　

　　1.将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲，去除样品中多余的介质。

　　

　　2.将封固剂涂在样品上。用24 x 60毫米的盖玻片覆盖安装好的样品，小心地将盖玻片放到封片剂上，以避免夹住任何气泡。

　　

　　Tip：建议使用硬化封片剂，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。

　　

　　3.等封片剂固定好。

　　

　　

　　第7步：显微观察

　　

　　使用可移除3孔腔室载玻片培养MCF-7细胞。用DAPI和染料490对细胞结构进行染色。圆形15mm盖玻片减少了所需的染色溶液的量。用硬化封片剂安装载玻片，可使样品长期保存。

　　

　　

　　图1 MCF-7细胞的肌动蛋白骨架用DYE 490鬼笔肽染色（左上），细胞核用DAPI染色（右上）。下图显示了合成图像，细胞核为蓝色，肌动蛋白骨架为绿色。（比例尺：100μm）

　　

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