本实验描述了将斑马鱼幼虫嵌入低百分比低熔点琼脂糖进行延时显微镜观察的过程。根据科学问题，可以在琼脂糖嵌入的幼虫中观察不同的发育阶段：这可以包括在卵壳内的最初48小时的发育，或孵化后的时间（受精后48-120小时）。

　　

　　1.相关文件

　　

　　• µ-Slide 2 Well Co-Culture的使用说明书

　　

　　2.材料和试剂

　　

　　2.1.动物

　　

　　• 斑马鱼幼虫（受精后最长达120小时）

　　

　　2.2.缓冲液和溶液

　　

　　鱼类水（60倍）

　　

　　• 172克氯化钠（ROTH，P029.2）

　　

　　• 7.6克氯化钾（ROTH，6781.1）

　　

　　• 29克CaCl2 x 2 H2O（ROTH，CN92.2）

　　

　　• 49克MgSO4 x 7 H2O（ROTH，P027.1）

　　

　　• 加入脱离水达到10升

　　

　　鱼类水（1倍）

　　

　　• 160毫升鱼类水（60倍）

　　

　　• 20毫升0.01％（w / v）亚甲蓝（Sigma-Aldrich，M9140）在去离子水中

　　

　　• 加入脱离水达到10升

　　

　　Tricaine储备溶液

　　

　　• 4 g / l Tricaine / MS-222（Sigma Aldrich，A5040）

　　

　　• 0.02 M三氯甲烷（ROTH，4855.2），pH 9

　　

　　• 在去离子水中

　　

　　Tricaine使用溶液

　　

　　• 在鱼类水（1倍）中稀释Tricaine储备溶液，以最终浓度为160毫克/升（1:25）

　　

　　0.5% 低熔点琼脂(LMPA)

　　

　　• 可以批量制备并分成小份用于每个实验

　　

　　• 在微波炉中将0.5%（w/v）低熔点琼脂（Biozym, 840101）与鱼水（1x）一起煮沸，直到琼脂完全溶解

　　

　　• 让琼脂冷却到约35°C左右

　　

　　• 添加Tricaine库存溶液，最终浓度为80 mg/L（1:50）

　　

　　最终的低熔点琼脂浓度可以调整。例如，我们成功地使用了高达2%的低熔点琼脂，但决定使用0.5%的低熔点琼脂进行实验，因为它不太可能影响生理过程。

　　

　　2.3.设备

　　

　　

(ibidi, 81806)

　　

　　• 热混合器 (例如，Eppendorf，ThermoMixer C)

　　

　　• µ-Slide 2孔共培养载玻片，ibiTreat底部处理 (ibidi, 81806)

　　

　　• 塑料移液管

　　

　　• 可选: 小刷子

　　

　　• 显微镜

　　

　　3.实验步骤

　　

　　准备工作

　　

　　在开始实验之前，按照“缓冲液和溶液”部分的描述准备LMPA。保持在35°C，直到需要使用。如果琼脂已经提前准备好，可以在热混合器中重新加热 (~80°C)，然后让琼脂冷却 (~35°C)。

　　

　　装载

　　

　　在使用µ-Slide 2孔共培养载玻片之前，请先阅读说明书。

　　

　　在我们小组的某些实验中，对斑马鱼脊髓进行了机械性损伤。如果这样做，建议请在装载前让幼鱼恢复至少30分钟。在脊髓横切后，嵌入琼脂的初始存活率为80%。这些幼鱼在琼脂中观察48小时后也都存活了。未受伤的幼鱼的初始存活率接近100%。

　　

　　1. 使用三氯甲烷使用溶液麻醉斑马鱼幼鱼2分钟。

　　

　　2. 使用塑料移液管在µ-Slide 2孔共培养载玻片的每个孔中放置一只幼鱼，并使用一些多余的鱼水。

　　

　　3. 对每只幼鱼单独执行以下步骤（以避免变干）：

　　

　　3.1. 使用塑料移液管除去所有鱼水。

　　

　　3.2. 向小孔中加入50µl LMPA，以覆盖幼鱼。

　　

　　3.3. 使用刷子或小的移液管头将幼鱼定位到适当的位置（侧面位置，尽可能水平和直立，具有统一的对准，即始终向左，卵黄在底部）。

　　

　　4. 让LMPA凝胶固化（0.5%凝胶约需20-30分钟）。

　　

　　5. 可选：用包含80mg / L三氯甲烷库存溶液的1x鱼水覆盖固化的LMPA凝胶，以进行连续成像的麻醉。

　　

　　6. 用自带的盖子盖住µ-Slide 2孔共培养载玻片，以避免蒸发。

　　

　　7. 斑马鱼幼鱼已经上样好准备成像

　　

　　在48小时的成像期间，如果盖子紧闭，则无需在琼脂上方加入鱼水，因为标本不会变干。这也使得可以进行正置显微镜观察，而不必担心洒出来。

　　

　　

　　图1：斑马鱼幼虫嵌入LMPA中的µ-Slide 2孔共培养器。

　　

　　延时显微镜观察

　　

　　这种样品制备方法被用于连续延时显微镜，以及使用德累斯顿技术大学CRTD的核心设施——光学显微镜设施的各种显微镜在不同时间点拍摄某些视场的快照。 这包括倒置和正置，广角和共聚焦显微镜。

　　

　　

图2：A）斑马鱼幼虫受精后72小时，埋入琼脂3小时后的整个µ-Slide 2孔共培养器的亮场瓦片扫描，共有18条幼鱼。

　　

　　视频：此示例显示了一个短20分钟的三维时间轴的Z投影，显示了受机械性脊髓切断处理的转基因mpeg1:mCherry斑马鱼幼虫受精后3天的情况。荧光标记的细胞是巨噬细胞和微胶质细胞。这个时间轴是用Dragonfly旋转盘显微镜（Andor）获取的。请见如下视频：