AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

　　为了研究肿瘤微环境影响下肿瘤细胞的运动性和侵袭特性，建立了体外2D侵袭方案。这种2D侵袭方案是一种共培养试验，在这种情况下，是由肿瘤和基质细胞（例如成纤维细胞）组成的。一旦两种细胞类型接触，在不同的条件下评估侵袭成纤维细胞单层的肿瘤细胞的数量，在我们的研究中，我们在模拟实体肿瘤微环境中发现的条件，例如与基质细胞（成纤维细胞）的相互作用以及成纤维细胞释放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我们使用A375黑色素瘤细胞系和真皮成纤维细胞进行了此测定。黑色素瘤细胞激活成纤维细胞，继而维持肿瘤细胞的生长，恶性转化和耐药性（Flach等，2011）。然而，在刺激所测试的抗癌化合物后，我们发现与成纤维细胞直接接触的黑素瘤细胞显示出运动能力受损并且未能侵袭成纤维细胞层。

　　材料和试剂

　　1. GFP-A375细胞系（ATCC）

　　2. 番茄皮成纤维细胞（从健康患者中分离）

　　3. MEF细胞培养基

　　4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

　　5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

　　6. 台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich;93595）

　　7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最终浓度下使用

　　8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm浓度下使用，用DMSO稀释

　　仪器设备

　　1. 层流净化罩

　　2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

　　3. 台式离心机

　　4. 细胞计数器

　　5. 2孔插件（ibidi: 80209）/预置2孔插件培养皿（ibidi:81176）

　　6.细胞培养管

　　7. 涡旋

　　8. 镊子

　　9. 光学显微镜

　　10. 荧光显微镜

　　11. NIS-Elements软件

ibidi:81176

　　实验流程

　　01. 将GFP-A375和番茄成纤维细胞系稳定地保存在MEF培养基中，在37°C和5%C02加湿培养箱中。

　　02. 当细胞达到亚融合度（约80％融合度）时，在带有PBS的通风橱中清洗它们，以去除死细胞和碎片。

　　03. 在培养箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化细胞约5分钟，然后添加MEF培养基以阻止反应。

　　04. 将细胞悬浮液收集在15ml细胞培养管中，并用台式离心机（1500xg,5´,RT）短暂离心。

　　05. 将细胞重新悬浮在新鲜培养基中；将一体积的细胞悬液与另一体积的台盼蓝溶液混合，用细胞计数器计数活细胞。

　　06. 在MEF缓冲液中以4x105细胞/ml的浓度稀释细胞。

　　07. 在多孔板上，在每个孔的中间放置一个Culture-Insert2孔（2孔培养插件）。

　　08. 用75µl（3x104细胞）FP-A375细胞填充插入物一侧，并用番茄成纤维细胞填充另一侧。用移液器上下混合插入物中的细胞，以确保细胞完全分布。

　　09. 将多孔板放在培养箱中，放置过夜。

　　10. 第二天，在镊子的帮助下，小心地从每孔中取出培养基和插件，并用PBS清洗。

　　11. 小心除去PBS，然后加入新鲜的MEF培养基。

　　12. 用光学显微镜检查GPF-A375与Tomto成纤维细胞之间产生的间隙的闭合状态。

　　13. 一旦每个孔中的间隙完全闭合，请使用荧光显微镜和成像软件获取荧光图像。确保肿瘤细胞尚未侵入成纤维细胞单层。

　　14. 小心地除去培养基，并在控制组孔中添加培养基+0.1％PBS，在处理组孔中添加培养基+300nM丝裂霉素A。将板放在培养箱中24小时（处理孵育时间）。

　　24小时后，在荧光显微镜下重新采集共培养孔，以评估治疗组与对照组（绿色荧光细胞散布在红色标记层上）的肿瘤细胞侵袭行为的任何变化（图2）。

图1：2D侵袭系统的示意图

图2：2D侵袭检测的荧光图像

　　将黑素瘤细胞和成纤维细胞共培养，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小时后，评估侵袭成纤维细胞层的肿瘤细胞的数目。A375细胞显示出大规模的侵袭行为，受到MithramycinA治疗的损害。比例尺：500μm。

　　备注：

　　1.此处描述了MEF培养基组成（参考文献1）。

　　2.此文仅供参考。

　　3.此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者。

　　参考文献：

　　1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,NúñezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

　　2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,KäsJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

　　3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k