本应用是在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中对球体进行荧光染色的示例。

我们使用荧光素二乙酸酯 (FDA) 和碘化丙啶 (PI)，这是用于分别区分活细胞和死细胞的标准染色。FDA 被活细胞吸收，将非荧光 FDA 转化为绿色荧光代谢物荧光素。测量的信号用作活细胞的指标，因为转化是酯酶依赖性的。相比之下，细胞核染色染料 PI 不能通过活细胞的细胞膜。只有在死细胞中，它通过无序的细胞膜区域到达细胞核，并插入细胞的 DNA 双螺旋。

同时使用这两种荧光染料可以轻松区分 3D 球体中的活细胞和死细胞群。

重要提示：

与标准方案相比，使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 进行染色需要更多的孵育时间和更多的洗涤步骤。这是为了确保染料和抗体充分扩散到利基区域。

相关文件：

在球体灌注载玻片中生成L929球体并进行动态培养实验

关键词：

荧光显微镜、活细胞成像、活/死细胞染色、二乙酸荧光素 (FDA)、碘化丙啶 (PI)

材料:

· μ-Slide Spheroid Perfusion Bioinert (80350, ibidi, Germany) 用于 L929 球体制备，见上面相关文件内容详情

· PI（CN74.2， Carl Roth）

· FDA (F7378, Sigma Aldrich)

· 细胞培养基（21875034，RPMI-1640，Gibco）

· 带有合适滤光片组的荧光显微镜

染色:

· 在无血清细胞培养基中制备染色溶液，以获得 PI 的最终浓度：200 µg/ml 和 FDA：80 µg/ml。

· 根据说明进行培养基更换并填充染色溶液。

· 在 37°C 和 5% CO2下孵育 30 分钟。

· 进行培养基交换并填充细胞培养基。此洗涤步骤将去除染色溶液。洗三遍。在每个洗涤步骤之间等待 10 分钟。

成像-结果:

· 用合适的滤片组在荧光显微镜下观察细胞。

· 或者，叠加图像以创建合并图像。

使用 ibidi 泵系统以 0.75 毫升/分钟灌注培养 14 天后，在 µ-Slide 球体灌注中用FDA/PI对 L929 球体进行活/死染色，Bioinert。绿色：活细胞（二乙酸荧光素，FDA）；红色：死细胞（碘化丙啶，PI）。宽场荧光显微镜，10x 物镜。