细胞趋化实验新方法（二）--实时观察细胞动态
案例：细胞作为趋化因子
上篇ibidi细胞趋化应用中（见链接： ）以Dendritic cell对CCL19细胞趋化反应为例介绍了细胞趋化的新方法。
本案例将介绍如何用细胞作为细胞运动的化学趋化因子。
如图所示：观测通道中可以使用贴壁细胞，或者是3D培养的细胞。用于趋化的细胞可以直接注入其中一个储液池中（图一）。
图一：A待观察细胞为贴壁细胞，受到左边的储液池中细胞影响具有了趋化行为。B待观察细胞为3D培养细胞，在基质胶中同样也受到了储液池中的细胞的影响具有趋化行为。
一、实验材料准备：
1.仪器：
● 细胞培养箱（高湿度，37℃，5%CO2）
● 倒置显微镜，具有10X相差物镜和定时拍照功能
● 镜载加热孵育系统（37℃，5%CO2）
● 可选配置：全自动载物台，自动对焦系统
● 分析软件：可选用手动分析软ImageJ的“Manual Tracking”模块，或全自动的ibidi提供的WimTaxis进行细胞轨迹追踪。使用ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 进行数据统计分析。
1.实验材料准备：
实验前一天准备工作：
为了减少ibidi细胞趋化载玻片与培养基中的气泡，将载玻片和培养基提前24小时放入培养箱中
表三：制备1.6mg/ml 基质胶
操作步骤：
● 使用表一中的培养基制备 9 x 106 cells/ml 的细胞悬液
● 在1.5ml离心管中小心混匀表三中的1和2号试剂，避免产生气泡
● 在另一1.5ml离心管中准备150 μl collagen I
● 使用200μl枪头从第二步的混合液中吸取30μl（图一A）
● 小心混匀（图一B），避免产生气泡
● 加入90μl细胞悬液到上一步混合液中（图一C）
● 小心混匀（图一D），避免产生气泡
图一：制备细胞-基质胶混合液图示，注意：1）避免产生气泡，气泡会破坏胶原纤维，不能使用Vortex；2）胶原混合后，离胶凝大约有5分钟时间，如果在凝胶后再进行操作会破坏胶原纤维；3）当刚加10x MEM到NaHCO3中的时候会看到颜色变化，这表明没有充分反应，因此加入混合液到胶原蛋白中后要充分混匀。
一.细胞趋化实验
1.趋化试剂
● 细胞趋化物：作为趋化因子的细胞 1-5 x 105 cells/ml
● 培养基：建议使用同一种培养基，并且需要优化一下血清浓度，建议使用低浓度的血清，减少由于血清造成的生长因子而减弱了趋化造成的影响。
1.实验步骤
开始细胞实验之前，要准备一个湿盒将细胞趋化载玻片放在湿盒中。可以用一个放了浸湿的纸巾的10cm培养皿作为湿盒（如图二）。
贴壁细胞准备：
● 如图，用小塞子将C、D、E、F塞紧。使用20μl的枪头从A中加入6μl细胞悬液。并使用同一个枪头立即从B孔向外吸。直到观测通道被细胞悬液充满。
● 在注液孔中加入培养基到图示位置（图三(B)）。移走所有小塞子。将载玻片放在培养箱中等待细胞贴壁。
图三：(A)示意向观测通道中加入带观测细胞悬液。(B)图表示注液孔的切面图。
● 1-5小时后，用显微镜检查细胞是否完全贴壁，如果完全贴壁，需要更换培养基。用小塞子将C、D、E、F塞紧。从A中加入10μl新鲜培养基。注意不要加入气泡。同样用同一个枪头从B向外吸。
● 重复三次。
● 在注液孔中加入培养基到图示位置（图三(B)）。移走所有小塞子，将A、B孔塞紧，准备开始趋化实验。
图四：细胞贴壁后用无细胞培养基更换观测通道中的培养基。
3D细胞准备
● 如图，用小塞子将C、D、E、F塞紧。使用20μl的枪头从A中加入6μl细胞-基质胶混合液。并使用同一个枪头立即从B孔向外吸。直到观测通道被细胞-基质胶混合液充满。
● 在注液孔中加入基质胶到图示位置（图五(C)）。移走所有小塞子。小心将A、B孔塞紧，将载玻片放在培养箱中30-35分钟，等待胶凝固后开始趋化实验。
图五：(A)向观测通道加入细胞-基质胶混合液。(B)用同一个枪头从另一个孔中向外细。(C)注液孔切面图。(D)将A、B口塞紧，开始趋化实验。
加入趋化细胞：
● 细胞贴壁或胶凝固后，将C、D两个孔用塞子塞紧。从E中加入65μl新鲜培养基，充满整个储液池。（图六）
● 再小心移除C、D两孔的塞子。把E、F两孔塞紧，同样的操作从C加入65μl培养基。
● 用20μl枪头从C中加入15μl作为趋化因子的细胞悬液，用同一个枪头从D中吸出15μl。
● 重复上步操作，加入总量30μl的细胞悬液。
● 将所有孔塞紧，静置30分钟后，就可以进行图像采集。
图六：加入作为趋化因子的细胞。需先用无细胞的培养基将储液池充满，再逐渐加入细胞，加入后将所有塞子塞紧静置一会，再开始实验。
● 对照，在两边储液池中均加入60μl的无化学趋化物培养基作为空白对照（-/-），和两个储液池均加入30μl细胞悬液作为阳性对照（+/+）。
● 按说明，将通道加液孔塞紧后可以进行图像采集。
● 将载玻片置入镜载加热孵育系统中，调整好采集位点，开始录制实验结果。
三、图像处理
1.手动细胞轨迹追踪
● 下载ImageJ，并安装Manual Tracking模块
● 导入采集的系列图像到ImageJ中，打开模块“Manual Tracking”，选择“Add track”开始记录细胞轨迹
● 选择一个细胞，按照时间点单击细胞，第一点击后，会有新窗口跳出来显示初始位置，以后每次点击，都将在这个新窗口中产生一个该细胞随着时间的新坐标
● 统计完足够的细胞轨迹后，保存轨迹坐标表格
● 至少收集30个细胞的轨迹才具有统计学意义，避免同一细胞追踪两次，去除由于凋亡会而不能采集完整的轨迹的细胞
● 可以将“Overlay dots & lines”以.avi格式导出
2）全自动细胞轨迹追踪
使用ibidi的WimTaxis自动分析平台，将采集的系列图像上传到该平台，几个工作日后，会得到细胞轨迹的坐标表格数据结果。
四、数据处理
使用迁移指数（ Forward Migration Indices*，FMIs）作为比较趋化实验和对照试验的参数。在有趋化物的情况下，空白对照的FMI和与趋化物垂直方向的化学趋化的迁移指数（FMI┴）应是在0点左右。而与趋化物平行方向的化学趋化的迁移指数（FMI‖）与0点有显著的区别表现出了化学趋向性。同时，使用Rayleigh Test**对细胞趋化的方向性进行检验。如果p值大于0.05表示了细胞运动的无序性，表明没有方向性的迁移。此外，迁移速率等参数也能直接用于分析。
*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)
**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993)
